USO DEL BIFONAZOL AL 1% SHAMPOO EN TRATAMIENTOS DE MALASSEZIA PACHYDERMATIS EN CANINOS.

USO DEL BIFONAZOL AL 1% SHAMPOO EN TRATAMIENTOS DE MALASSEZIA PACHYDERMATIS EN CANINOS.


Autores:
Dra. Maria Jose Neira D. M.V
Dr. Claudio Simón C. MVDiplomado Medicina Pequeños animales Universidad De ChilePasantía en Dermatología Universidad de Sao Paulo Brasil.Clínica Veterinaria Full Animals.clausimon@fullanimals.clSantiago Chile, 2007


Resumen
El objetivo del presente estudio fue determinar la acción y efectividad del tratamiento con Bifonazol 1% shampoo sobre Malassezia pachydermatis. El diagnostico de esta levadura se realizó utilizando la técnica citológica con cinta adhesiva doble fas. Este método es el más eficaz en relación a la cuantificación e identificación de Malasasezia pachydermatis.

Una vez diagnosticada la dermatitis por Malassezia se inició el tratamiento con bifonazol por un período de 15 días realizando baños alternados cada 3 días.

Según los resultados obtenidos en este estudio podemos concluir que la terapia tópica con Bifonazol 1% shampoo tuvo una efectividad total cercana al 84% en el total de los pacientes evaluados, basados en la disminución de la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo.

Summary
The objective of the present study was to determine the action and effectiveness of the treatment with Bifonazol 1% shampoo on Malassezia pachydermatis. I diagnose of this yeats am made using the cytological technique with sticky tape double fas (using piecesof tape clear cellophane). This method is but effective in relation to the quantification and the identification of Malasasezia pachydermatis. Once diagnosed the dermatitis by Malassezia the treatment with bifonazol by a period of of 15 days making alternate baths begins every 3 days.

Once diagnosed the dermatitis by Malassezia we started the treatment with bifonazol by a period of 15 days making alternate baths begins every 3 days.

According to the results obtained in this study we can conclude that the topical therapy with Bifonazol 1% shampoo had a total effectiveness near 84% in the total of the evaluated patients, based on the diminution of the amount average of Malassezia pachydermatis by field.


INTRODUCCIÓN

La piel tiene gran importancia lo que ha provocado que diversos autores la denominen como el espejo de la salud. Esto porque la piel puede alterarse por diversas patologías, entregando al clínico importantes elementos para juzgar el estado de salud de su paciente.

Las patologías dermatológicas en los animales tienen una alta frecuencia en relación al total de consultas en clínicas veterinarias, por esto es importante realizar una exploración eficiente de este órgano. Este puede ver alterada su estructura por enfermedades cuyas lesiones fundamentales, primarias o secundarias, tienen su asiento en la piel. Dentro de estas patologías se encuentran aquellas de origen bacteriano, parasitario, viral y principalmente las de origen fúngico como son las dermatitis por levaduras (Muse, 2001).

Una de las levaduras que pueden ser aisladas frecuentemente en caninos como componente de la flora cutánea normal es la Malassezia pachydermatis, la cual debido a la alteración de diversos factores pueden desencadenar patologías dérmicas.

En base a lo anterior el presente trabajo tiene por objeto determinar la eficacia de un nuevo procedimiento en base a Bifonazol 1% shampoo para el control de la presencia patológica de Malassezia pachydermatis.


1.1. Objetivo general

Evaluar la acción antimicótica del Bifonazol al 1% ante la persistencia patológica de Malassezia pachydermatis en caninos


1.2. Objetivos específicos

· Observar y diagnosticar en forma microscópica la presencia de Malassezia pachydermatis en el estrato corneo de la piel mediante examen citológico por impronta cutánea utilizando Cinta Adhesiva Doble Fas.

· Cuantificar e identificar microscópicamente la persistencia de Malassezia pachydermatis posterior al tratamiento con Bifonazol 1% shampoo.






2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Características generales de la piel

La piel es el órgano más grande del organismo y, dependiendo de la especie y de la edad, puede representar entre un 12 a un 24% del peso corporal de un animal y su pH fluctúa entre 6.2-7.8 dependiendo de la zona (Merck, 2000). La piel posee varias funciones las más importantes serán mencionadas a continuación:

o Proteger al organismo de influencias externas físicas, químicas y biológicas

o Aislar al cuerpo del medio ambiente.

o Regular temperatura gracias a la evaporación de líquidos corporales.

o Producción de pigmentos y vitamina D.

o Percepción sensorial.

o Función inmunológica.

2.2. Estructuras de la piel

Dos de los componentes principales de la piel son la epidermis y dermis. Estos dos componentes son interdependientes y bien diferenciados y su función varía de acuerdo a las estructuras que los componen.

Figura 2.1. Estructura de la piel.








Fuente: García, 2003




2.2.1. Epidermis

Capa más superficial de la piel, se compone de múltiples capas celulares:

o Queratinocitos: Son las células que se encuentran en mayor abundancia y le dan forma y funcionalidad a la piel.

o Melanocitos: Localizadas en la capa basal y el folículo piloso, son células dendríticas cuya función es producir el pigmento café de la piel que es sintetizado a partir de la tirosina.

o Células de Merkel: Se ubican entre las células basales y están clasificadas como mecanoreceptores. Se localizan en los dedos, cavidad oral y en la vaina externa del pelo.

o Células de Langerhans: Son células dendríticas presentadoras de antígenos y están relacionadas con los mecanismos de hipersensibilidad mediados por células.

Esta capa presenta renovación continua, es avascular y se nutre por difusión de la dermis. La descamación es de manera invisible o en segmentos celulares llamados caspa.
La epidermis tiene un ciclo de recambio de 22 días en el perro normal, presenta una membrana basal que sirve como lugar de anclaje de las de células epidérmicas y como barrera de protección entre la epidermis y la dermis. Esta también sirve de soporte a los siguientes estratos: E. Corneo, E. Lucido, E. Granuloso y E. Espinoso (Muller y Kirk’s, 1997).

-Estrato basal: Esta formado por una sola línea de células cilíndricas. Estas células se ubican en la unión dermoepidérmica y se unen a ella por unas estructuras de unión llamadas hemidesmosomas. En este estrato las células se están dividiendo constantemente y al microscopio se aprecian numerosas mitosis. Las Células Basales tienen filamentos de aproximadamente 10 nm de diámetro que son citoqueratinas. Conforme la célula asciende a estratos superiores, el número de filamentos aumenta, llegando a ser en el estrato córneo casi el 50% de sus proteínas En cuanto a su morfología estas células son columnares bajas o cuboides, con su eje largo alineado verticalmente con respecto a la superficie de la piel (Merck, 2000).

-Estrato espinoso: Formado por 2 a 3 filas de células que sintetizan queratina. Por lo general se observan con mayor nitidez en los cojinetes plantares y morro. Se llama de esta forma porque al ser visto con el microscopio se observan en forma de espinas las uniones celulares o desmosomas. Las células tienen forma polihédrica y usualmente son de 3 a 8 capas de células. Las células presentan en su citoplasma muchos haces de filamentos los cuales convergen en los desmosomas. Estos filamentos o tonofibrillas le dan a las células cierta resistencia contra la fricción. El estrato basal con el estrato espinoso forman el estrato de Malphigi (Ruiz, 2005).

-Estrato granuloso: Recibe este nombre puesto que al ser observadas con el microscopio se pueden observar gránulos basófilos queratohialinos, estos gránulos son ricos en proteínas que contienen histadina. Hay otro tipo de gránulos llamados lamelares que solo son visibles con el microscopio electrónico y estos contienen fosfolípidos y glicosaminoglicanos. Estas sustancias son liberadas al espacio intercelular y en la capa cornea forman una especie de cemento intercelular que actúa como barrera contra el medio externo. Este estrato está formado de 3 a 5 capas de células (Ruiz, 2005).

-Estrato lúcido: Células aplanadas anucleadas, sin perfiles definidos. Está presente solamente en zonas muy queratinizadas y sin pelo, en perros solo se encuentra en los cojinetes plantares (Ruiz, 2005).

-Estrato corneo: Es la capa más externa y se renueva constantemente es el que previene la entrada de microorganismos y agentes ambientales dañinos además evita la pérdida de fluidos corporales. Esta capa esta formada de queratinocitos completamente maduros que contienen proteínas una de ellas es la queratina. Las células son planas y no presentan organelos intracitoplasmáticos los cuales ya fueron digeridos por enzimas lisosomales (Ruiz, 2005).

2.2.2. Dermis

Es una parte integral del sistema tisular conectivo del cuerpo y es de origen mesodérmico. En la dermis se pueden encontrar normalmente los siguientes tipos de células:

Fibroblastos: célula de origen mesenquimatoso células especializadas en la síntesis de las fibras de colágeno, elásticas y reticulares. Los fibroblastos también tienen que ver con la destrucción del colágeno pues producen colagenasas y lipasas, enzimas encargadas de la degradación del colágeno (García, 2003).

Histiocitos: son macrófagos que se originan a partir de los monocitos de la sangre. Procesan y presentan antígenos, producen interleucinas, interferones, prostaglandinas, lisosimas y peróxidos (García, 2003).

Mastocitos: células que contienen gránulos con múltiples mediadores químicos los cuales son vasoactivos, quimiotácticos, el más importante de ellos es la histamina. Estas células responden degranulandose y eliminando estas sustancias frente a estímulos físicos, químicos e inmunológicos (Ruiz, 2005).

Morfológicamente la dermis esta compuesta por tres tipos de fibras:

Colágeno (representa el 95% del total de las fibras).
Elásticas.
Reticulares o protocolágeno.

Es responsable de la mayor parte de la profundidad, resistencia a las tracciones y la elasticidad de la piel, participa además en la remodelación, mantención y reparación de la piel. La dermis se mantiene unida gracias a una proteína llamada colágeno compuesta por fibroblastos. En esta capa se encuentran los receptores de dolor y del tacto (Muller y Kirk’s, 1997).

2.2.3. Hipodermis

La hipodermis, tejido subcutáneo, o también llamada subcutis está compuesta por tejido conjuntivo laxo, el cual contiene fibras elásticas que se entrecruzan formando mallas, las que limitan espacios o celdas que en circunstancias patológicas pueden contener líquido o aire y otros gases denominándose edema o enfisema respectivamente. Estos espacios están ocupados por tejido adiposo, el cual puede formar acumulaciones considerables en panículos como ocurre en los animales con exceso de grasa. Su función es la protección física a traumas, como aislante térmica y como reserva energética (García, 2003).

2.3. Historia, taxonomía y morfología del género Malassezia

El género Malassezia fue reconocido por primera vez en 1846 por Eichstedt, fisiólogo e histólogo francés, fue el primero en reconocer la naturaleza fúngica de la pitiriasis versicolor. En 1874 Malassez informó sobre células de varias formas en el estrato córneo de pacientes con diversas enfermedades de piel. Casi medio siglo después de conocida la etiología de la pitiriasis versicolor, Baillon, en 1889, creó el género Malassezia en honor a Malassez, con Malassezia furfur como especie tipo. La denominación de la especie hace alusión a las finas escamas, de consistencia furfurácea o parecida al salvado, que se desprenden de las lesiones en esta afección (Giusiano, 2006).

El género Pytirosporum fué introducido por Sabouraud en el año 1904 con el objeto de describir a las formas de levaduras sin filamentos miceliales aisladas de la piel normal. Castellani y Chalmers en 1913, llamaron Pityrosporum ovale a la forma oval y en 1951 Gordon denominó P. orbiculare a las levaduras esféricas presentes en piel con y sin lesiones.

En 1925 Weidman introdujo el nombre de P. pachydermatis para una especie no lipofílica aislada de animales, a la cual Dodge en 1935 propone incluirla dentro del género Malassezia, Gustafson obtiene este mismo microorganismo de otitis externas en caninos en el año 1955 otorgándole por error la categoría de nueva especie bajo la designación de P. canis (Giusiano, 2006).

La identificación de las diferentes especies de Malassezia se basan en las diferencias morfológicas, estructurales, moleculares, bioquímicas y apariencia de la colonia (Hernández, 2005).










CUADRO 2.1: Taxonomía del género Malassezia
CLASE FAMILIA GENERO ESPECIE
M. pachydermatis
M. furfur
Malassezia
Cryptoccocaceae
Basidiomicetos M. sympodialis
M. globosa
M. obtusa
M. slooffiae
M. restricta









Malassezia pachydermatis corresponde a un hongo levaduriforme, saprofito, no micelial lipofílico de forma oval o en maní con pared gruesa. Su forma típica se debe a la gemación unipolar de células hijas desde un sitio de la pared celular, también incluye en la capa interna de la pared un reborde en espiral distintivo de la especie (Muse, 2001). Esta levadura se caracteriza por poseer un tamaño de 2,5 a 5,5 x 3,0 a 6,5 micras (Marcon y Powell, 1992).

Desde el punto de vista fisiológico la principal característica de estas levaduras es que son obligatoriamente lipofílicas, debido a que tienen un defecto en la capacidad de sintetizar ácidos grasos saturados de C12–C16, lo que se manifiesta en el requerimiento de una fuente exógena de esos ácidos grasos para su desarrollo. Malassezia pachydermatis es la única especie del género que no requiere de sustancias lipídicas para su desarrollo (Carlotti, 2001)

Su crecimiento es a un pH óptimo entre 4.0 y 8.0, se inhibe entre 1.0 a 3.0 y 9.0 a 10.0, Debido a esto se cree que productos tópicos acidificantes serían una buena opción de terapia para cuadros de infección cutánea producidas por levaduras (Hernandez, 2005).

Malassezia pachydermatis puede ser aislada tanto en animales domésticos (perros, gatos, equinos) como en animales salvajes rinocerontes (primates, aves acuáticas, pájaros y carnívoros). En los animales estas levaduras en piel y mucosas, pero hasta el momento no se han reportado localizaciones más profundas (Carlotti, 2001).
2.4. Etiología y patogénesis de Malassezia pachydermatis

Muchos estudios han demostrado que Malassezia pachydermatis única especie no lipofílica, primariamente zoofilica, coloniza animales de sangre caliente y es raramente encontrada en piel humana. Es un componente de la flora cutánea normal del perro, particularmente el área perianal, los labios y extremidades (Outbridge, 2006).

La respuesta del hospedador a las levaduras incluye mecanismos de defensa no específicos como la fagocitosis por neutrófilos, además de mecanismos de defensa específicos mediados por células con participación de células T que se multiplican y producen linfoquinas estimulando la fagocitosis por macrófagos así como la multiplicación de células basales epidérmicas finalizando con la destrucción de las levaduras o su eliminación por descamación (Bonagura, 2001).

Los factores que pueden desencadenar esta patología incluyen alteraciones del microclima cutáneo y de los mecanismos de defensa del hospedador esto permite que Malassezia pachydermatis pueda multiplicarse y volverse patogénica. Los factores cutáneos que refuerzan la multiplicación de Malassezia incluyen:

Producción excesiva o modificación del sebo o cerumen.
Exceso de humedad.
Alteración de la barrera epidérmica.
Pliegues cutáneos.

Estos cambios pueden desencadenarse por diversas causas, las más comunes son:
Hipersensibilidad cutánea o atopia.
Pioderma.
Ectoparásitos, en especial demodicosis.
Desordenes endocrinos (hipotiroidismo).
Desordenes en la queratinización.
Tratamientos prolongados con glucocorticoides o antibióticos.

Malassezia pachydermatis posee mecanismos de adherencia a los corneocitos que aseguran su permanencia en el huésped, además de la producción de enzimas como Fosfolipasas, Proteasas, Hialorunidasas, Fosfatasas que pueden contribuir a la inflamación cutánea a través de proteólisis, lipólisis cambios del pH cutáneo, liberación de eicosanoides y activación del complemento, además de sustancias que inhiben otros organismos micóticos limitando la competencia y favoreciendo el microclima necesario para esta especie (Carlotti, 2001).

La actividad fosfolipasa y proteinasa de Malassezia., puede ser considerada un potencial determinante de virulencia y probablemente juegue un activo rol en la invasión de los tejidos del hospedador. La exposición a la fosfolipasa y a la proteinasa producida por los microorganismos induce la formación de poros en las membranas de las células epiteliales de los mamíferos, afectando las funciones celulares y favoreciendo la invasión del tejido. Esto explicaría el papel de estas enzimas en la ocurrencia de lesiones de piel.
Las fosfolipasas podrían ser consideradas uno de los tantos factores involucrados en la compleja interacción entre las levaduras y el hospedador, llevando al desarrollo de lesiones cutáneas (Giusiano, 2006)

Además, se ha demostrado que la Malassezia pachydermatis puede producir reacciones de hipersensibilidad tipo I, con presencia de prurito extremo y otros signos clínicos, pero con una baja cantidad de microorganismos (Bonagura, 2001).

2.5. Epidemiología

No existe ninguna predilección por edad o sexo. Algunas razas están predispuestas a la dermatitis por Malassezia como por ejemplo el West Highland, White Terrier, Basset Hound, Dachshund, Cocker Spaniel, Poodle, Pastor alemán, Collies, Shetland, Jack Russell Terrier, Springer Spaniel y Shar Pei (Muller y Kirk’s, 1997). Los factores predisponentes del huésped serian enfermedades alérgicas, trastornos en la cornificación (seborrea), afección bacteriana de la piel y administración prolongada de corticoides o antibióticos que se utilizan para el tratamiento de estos trastornos. La época en donde se presenta el mayor número de casos es al final de la primavera e inicios de verano aunque puede persistir en el invierno (Muller y Kirk’s, 1997).



2.6. Signos clínicos

Los signos clínicos asociados a dermatitis por Malassezia pueden ser variables y por lo general se relacionan a prurito, zonas eritematosas, escamas amarillas a grises, olor desagradable, pápulas, aspecto grasiento del pelo y de la piel. En estados crónicos se puede observar hiperpigmentación, liquenificación y alopecia traumática, no obstante estos signos clínicos se pueden encontrar en otros trastornos dermatológicos por lo tanto no establecen su diagnostico (Carlotti, 2001).

La ubicación más frecuente es en la parte ventral del cuerpo (cuello, axilas, vientre y área inguinal), zona facial (pabellón auricular, labios, hocico), área perianal y zona interdigital. También puede generalizarse. A veces se aprecia agrandamiento de los linfonódulos, pero más a menudo no hay ningún signo general (Nobre, M. et al, 2000).

2.7. Diagnóstico

Para un correcto diagnóstico de la presencia de Malassezia pachydermatis es importante considerar la historia clínica apoyado por el examen físico del paciente, confirmando el diagnóstico a través de métodos complementarios que permitan (en caso de presencia patológica) una respuesta eficaz y oportuna. Dentro de los exámenes dermatológicos que demuestran la presencia de Malassezia en la piel, podemos mencionar el examen citológico, histológico y cultivos fúngico de Malassezia (Jack, 2005).

Un método de rápida respuesta y a la vez accesible es el examen citológico, para el cual se puede recolectar muestras a partir de escamas o residuos de la superficie cutánea mediante:
o Raspado superficial.
o Fricción con hisopo sobre la piel.
o Presión de una cinta de celofán transparente.
o Directa utilizando el portaobjetos sobre la piel.

Para realizar un buen diagnostico se debe considerar cual es la cantidad promedio de Malassezias normal en piel, y que cantidad es patológica. En el Cuadro 2.2 se establecen los siguientes valores.

CUADRO 2.2. Rangos de Malassezia pachydermatis en piel

Cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo
Situación en piel según cantidad de Malassezia pachydermatis.
0-4 Malassezias por campo
NORMAL
4-10 Malassezias por campo
LEVE
10-20 Malassezias por campo
GRAVE
20 y más Malassezias por campo
CRÍTICO


Fuente: Larson, 1998

2.7.1. Muestras citológicas

La citología es la ciencia que estudia la morfología celular de diferentes partes del organismo. La colección de muestras citológicas es muy sencilla, económica y segura para el paciente convirtiéndola en una herramienta diagnóstica muy importante para el clínico.
Dependiendo del sitio de localización de la lesión y de las características clínicas adicionales que presente se determinará que método de muestreo más conveniente para cada caso. Por lo que hay que tener muy claro, que el éxito del diagnóstico citológico depende en gran medida de la calidad de la muestra obtenida; es decir, de la presencia de material celular suficiente y de la preparación adecuada de la muestra en cuanto a la fijación y tinción (Ruiz, 2005).

2.7. 2.Técnicas de extracción de muestras

a) Técnica por cinta adhesiva doble fas:

Esta técnica se utiliza para recolectar escamas y detritus cutáneos, la principal indicación de este test es el examen citológico de la superficie cutánea. La cinta adhesiva permite recolectar muestras de lugares delicados como son los pliegues cutáneos, en particular entre los espacios interdigitales, mucosas y uniones muco-cutáneas (Nobre, M. et al, 2000).

La técnica consiste en presionar la cinta por el lado adhesivo sobre la piel, posteriormente se puede pegar una parte de la cinta sobre la punta de una lámina de vidrio o bien usar la cinta como muestra, luego se procede a colorear el material escogido, para observarlo al microscopio en el máximo aumento. Esta técnica es especialmente útil para evaluar Malassezia u otros ítems de interés que pueden ser identificados incluyendo células inflamatorias como neutrófilos (que pueden aparecer en epidermis en respuesta a una infección superficial), células epiteliales nucleadas (que no son normales y reflejan una anormalidad de queratinización), etc (Nobre, M. et al, 2000).

2.7.3. Tinción Diff-Quick ®

Es una tinción rápida, de buena calidad, en la cual participan tres reactivos: Metanol 985 como fijador, Buffer Eosina y el Fosfato buffer de azul de metileno la cual aplicada sobre el portaobjeto permite una tinción adecuada de levaduras y bacterias. Para la formulación de este colorante hay que realizar un preparado especial para cada tinción.

Pertenece al grupo de las tinciones de Romanowski y se le define como un precipitado negro formado por la adición de soluciones acuosas de azul de metileno y eosina disueltos en metanol (Ellis, 2007).

La coloración Diff-Quick ® se diseñó para que el citoplasma se tiña de rosado y azul el núcleo, y que además ocurra la fijación de películas finas de tejido u otros extendidos. En el caso de levaduras como es el caso de Malassezia pachydermatis estas adquieren una coloración azul oscura (Ellis, 2007).

Cuadro 2.3. Preparación de colorantes
Componente
Cantidad
Metanol
98%
Eosina

Eosina
0,3 g
Ácido acético glacial
0,25ml
Agua destilada
100 ml.
Azul de metileno

Azul de metileno
1 gr.
Agua destilada
100 ml.


El material es transferido a un porta objetos y fijado por calor para realizar las tinciones para posteriormente evaluar microscópicamente la presencia del microorganismo (Omodo-Eluk et al, 2003).

2.7.4. Diagnostico diferencial

El diagnostico diferencial incluye a la mayoría de las patologías en las que se presente prurito, eritema y seborrea como lo son: Enfermedades alérgicas, Foliculitis bacteriana, Demodicosis, Reacción a drogas, antibióticos y Acantosis nigrigans.

2.8. Tratamientos convencionales para Malassezia pachydermatis

Los antimicóticos de preferencia para este tipo de patología son los denominados azoles de amplio espectro estos se dividen en imidazoles y triazoles. Los más efectivos son los que afectan la membrana citoplasmática del hongo y su utilización varía de acuerdo a la presentación del producto y al tipo de micosis, es decir, superficiales, subcutáneas, sistémicas o profundas.

La terapéutica en este caso, debe estar enfocada tanto hacia la levadura como a cualquier problema predisponente, en consideración a que Malassezia pachydermatis es parte de la flora microbiana normal de la piel, por tanto no siempre es posible eliminarla por completo (Marcon y Powell, 1992).

2.8.1 Antimicóticos Sistémicos

Los más utilizados como tratamiento contra Malassezia pachydermatis se mencionaran brevemente a continuación:

Ketoconazol: Es el fármaco que se administra de manera más amplia, por vía oral es de amplio espectro incluso dermatofitos, blastomicosis, histoplasmosis, coccidiodomicosis, tiñas, pitiriasis versicolor, candidiasis mucocutánea crónica, vulvovaginitis por cándida, candidiasis bucal y de esófago (Goodman, 2003).

Se distribuye en todo el organismo y se metaboliza en hígado. Se excreta por heces y bilis y orina. Por vía tópica prácticamente no se absorbe. Necesita pH ácido para que ocurra la absorción gastrointestinal, es decir, debe administrarse con las comidas. La administración de Bloqueadores H2 disminuye la absorción (Goodman, 2003).


v Efectos colaterales.: Alergia, caída del cabello, alteraciones endocrinas, irregularidades en el ciclo, ginecomastia y disminución de líbido, disminución plasmática de hormonas .esteroideas (se puede usar como antiesteroideo para el Cushing) puede producir incremento de aminotransferasas y colangiohepatitis por lo que se debe controlar función hepática (hepatotoxicidad) (Muller, 2007).

v Dosis: 5 a 10 mg/kg diarios por 10 días posteriormente la misma dosis pero en días alternos por 10 días más (Muller, 2007).

v Itraconazol: Triazol relacionado con ketoconazol. Se absorbe por vía oral, menos efectos adversos que ketoconazol. Espectro más amplio. Activo contra los mismos hongos que el Ketoconazol y el Fluconazol, pero con mayor actividad contra el Aspergillus. Se usó en Blastomyces dermatitidis e Histoplasma capsulatum. La absorción oral varía entre pacientes, disminuye en ayuno o pH gástrico elevado, Se metaboliza en hígado (Valsecia, 2004).

v Interacciones: Rifampicina, Fenilhidantoína y Carbamazepina, bloqueadores H2 y bloqueadores hidrogeniones. Aumentan las concentraciones toxicas de Digoxina, Ciclosporina y Fenilhidantoína, Terfenadina y Aztemizol y puede producir ondas QT prolongadas, con arritmias ventriculares fatales (Muller, 2007).

v Efectos adversos: Nauseas, vómito, diarrea, dolor abdominal e hipocalemia, en inmunocomprometidos: rash , prurito y urticaria. Menos frecuentes: mareo, dolor de cabeza, angioedema, anafilaxia, fatiga, hipertensión y hepatotoxicidad, pero menos que el ketoconazol (Valsecia, 2004).

v Dosis: 5 a 10 mg/kg cada 24 hrs (Muller, 2007).


2.8.2 Antimicóticos de uso tópico

El tratamiento tópico es empleado ampliamente siendo importante que estos preparados tópicos posean actividad desengrasante y antimicótico, con cierto efecto residual a modo de disminuir la recurrencia del problema (Bonagura, 2001).También se sugiere el uso de shampoo en base a diversos productos antimicóticos, sin embargo la acción del enjuague limita el efecto residual, por tanto se sugiere no enjuagar al animal posterior a la aplicación del producto con el fin de lograr una concentración optima en piel.(Melman, 2005).

El antimicótico tópico ideal debe reunir las siguientes características:

v Acción fungicida (mejor que fungistática).

v Amplio espectro frente a los hongos causantes de micosis superficiales cutaneomucosas (dermatófitos, levaduras del género Candida, Pityrosporum y mohos).

v Actividad in vitro demostrada con pruebas de sensibilidad (CMI) para los hongos mencionados.

v Probada eficacia clínica en la resolución de las distintas dermatomicosis.

v De fácil accesibilidad, disponible en farmacia sin prescripción médica obligada.

v Disponible en diversas presentaciones y de fácil aplicación.

v No absorbible o con escasa absorción por piel, con buena penetración en el estrato córneo, capaz de alcanzar una alta concentración en los tejidos lesionados y buena relación coste-eficacia (Maestre, 2001).


A) Derivados azólicos


Los antifúngicos azólicos son preparados sintéticos constituidos por diferentes anillos
fenílicos, cuya característica común es la presencia de uno o más anillos de cinco elementos en cuya estructura están presentes dos moléculas de nitrógeno (imidazoles) (Goodman, 2003). Se dividen en imidazoles y en triazoles.

Cuadro 2.4 Clasificación de antifúngicos azólicos
Mecanismo de acción

El principal mecanismo de acción de los imidazoles fue demostrado por primera vez por Vanden Bossche en 1978. Este autor comprobó que concentraciones bajísimas de Miconazol eran capaces de bloquear la síntesis de ergosterol en Candida albicans, lo que producía la acumulación de diferentes 14-a-metil-esteroles a nivel celular. Este fenómeno sugería que los azoles inhibían la 14-a-demetilación en la cadena de la síntesis de los esteroles celulares (Figura 2.2.).

Esta inhibición no tiene lugar selectivamente a nivel de la célula fúngica, sino que también afecta a la síntesis de colesterol de las células animales, aunque para ello se requieren dosis de azoles mucho más elevadas. La auténtica diana que utilizan los azoles para inhibir la 14-a-demetilación del lanosterol es una proteína Hem del citocromo p-450, bloqueando el lugar reservado para el oxígeno. La depleción de ergosterol altera la fluidez de la membrana reduciendo la actividad de enzimas asociadas a ésta, aumentando así la permeabilidad e inhibiendo el crecimiento y la replicación celular. Este efecto no deseado de inhibición de la síntesis de esteroles humanos por los imidazoles ha sido utilizado con Ketoconazol para el tratamiento de enfermedad de Cushing o cáncer de próstata.

Además de la inhibición de la síntesis de ergosterol, algunos imidazoles (denominados por algunos autores de primera generación, ver más abajo) poseen un efecto directo sobre la membrana celular (Florez, 2004). Este efecto se pone de manifiesto mediante el efecto sinérgico que tiene lugar entre estos imidazoles y determinados detergentes.
Se ha demostrado cómo la ocupación de la bicapa lipídica celular por este tipo de azoles es mucho más elevada que la que se observa con azoles que no tienen este efecto directo sobre la membrana celular, como es el caso de Ketoconazol. Este efecto directo sobre la membrana celular conlleva un efecto fungicida, a diferencia de la inhibición de la síntesis de ergosterol, que produce un efecto fungistático.

Una tercera capacidad de los azoles consiste en la posibilidad de inhibición de la ATPasa de la membrana celular fúngica, actividad descrita al menos con miconazol y ketoconazol. Ello puede colapsar rápidamente el gradiente de electrolitos y disminuir el ATP intracelular. Por último, otro fenómeno relacionado con diferentes antifúngicos azólicos ha sido la inhibición de transformación morfogenética de levadura a micelio, observado en algunos casos (Florez, 2004).

Clasificación

Los antifúngicos azólicos se pueden dividir en tres grandes grupos, en relación a su desarrollo histórico y función, más que en su composición química.

La primera generación son los derivados tópicos. Al igual que todos los imidazoles, estos alteran la composición de los esteroles de la membrana fúngica, mediante inhibición del citocromo p-450, pero además de ello, los agentes tópicos ejercen una acción fungicida por daño directo de la membrana celular, como ya se ha comentado. La segunda generación son los compuestos orales con actividad sistémica, cuyo máximo relevante es ketoconazol. No poseen, al igual que los de primera generación, el efecto directo sobre la membrana celular que tienen los del anterior grupo.

La tercera generación son los derivados triazólicos, a pesar de su excelente actividad in vivo, la correlación in vitro de dicha actividad, circunstancia que comparten con los de segunda generación, es muy difícil de demostrar y es muy dependiente de las condiciones ambientales. Un aspecto importante a la hora de evaluar la actividad inhibitoria, es el estado fisiológico y la fase de crecimiento de la célula fúngica. La mayoría de los azoles de primera generación son fungicidas al añadirse a cultivos de levaduras en fase de crecimiento exponencial, incluso tioconazol y en menor medida miconazol, también muestran esta actividad fungicida en fases estacionarias. Sin embargo, los azoles de segunda y tercera generación son siempre fungiestáticos, independientemente de la fase de crecimiento en la que se analice (Letelier, 2006).

Resistencia a los azoles

Se han descrito básicamente tres mecanismos de resistencias a los derivados azólicos:

1. Disminución de la permeabilidad de la membrana antifúngica producida por los cambios en la composición del ergosterol: Las cepas que poseen este mecanismo tienen en su membrana niveles altos de esteroles no esterificados, con un cociente fosfolípido/esterol de aproximadamente la mitad de lo que tienen las cepas sensibles. Parece que la penetración de los azoles es variable y hay diferencias entre los muy lipofílicos y los hidrofílicos, que podrían explicar algunos casos de resistencias no cruzadas (Letelier, 2006).

2. Mutación de la enzima lanosterol-14ademetilasa: Condicionando una menor afinidad por los imidazoles (Letelier, 2006).

3. Sobreproducción de las enzimas del citocromo p-450: Provocando un aumento de la síntesis de esteroles y contrarrestando la acción de los azoles. Además de estos tres mecanismos, en algunas especies estudios recientes han demostrado la presencia de una bomba activa que extrae azoles de su diana enzimática confiriendo resistencia. Cuando se habla de resistencia en antifúngicos hay que tener en cuenta los siguientes conceptos:

1. Resistencia intrínseca: Cuando ningún miembro de una especie es sensible a un
Antifúngico (Letelier, 2006).

2. Resistencia primaria: Se aplica a una cepa perteneciente a una especie normalmente sensible al antifúngico que posee una resistencia natural al mismo sin haber estado en contacto previamente (Letelier, 2006).

3. Resistencia secundaria: Cuando una cepa previamente sensible adquiere resistencia al antifúngico tras haber estado en contacto con él (Letelier, 2006).

2.9. Bifonazol

Este producto es un derivado de los imidazoles de uso tópico, utilizado desde 1983 principalmente a nivel de medicina humana, sin mayores registros de su uso a nivel veterinario (Bibliomed, 2000).

2.9.1. Mecanismo de acción

Pertenece a los derivados azólicos de primera generación. Al igual que todos los imidazoles, estos alteran la composición de los esteroles de la membrana fúngica, mediante inhibición del citocromo p-450 , inhibiendo las enzimas oxidativas como la esterol 14-alpha-desmetilasa, deteriorando la síntesis de ergosterol de la membrana acumulándose 14-metilesterol, estos últimos pueden romper la unión estrecha de los fosfolípidos, afectando las funciones de las enzimas de membrana e inhibiendo el crecimiento fúngico, pero además de ello, los agentes tópicos como lo es el caso de Bifonazol, ejercen una acción fungicida por daño directo de la membrana celular, como ya se ha comentado (Álvarez, 2006).


Figura 2.2. Mecanismo de acción de los azoles
AcetilCOA
Escualeno
Lanosterol
4,14-dimetillanosterol
Ergosterol
Azoles
14-α-desmetilasa










Fuente: Propia

2.9.2. Indicaciones terapéuticas

Antimicótico de amplio espectro fungicida con efecto antinflamatorio específico para micosis de las uñas de los pies y manos producidas por dermatófitos levaduras (Candida albicans) y mohos originando el desprendimiento atraumático de la porción afectada de la uña (onicólisis selectiva) (Álvarez, 2006).

El amplio espectro in vitro del bifonazol en humanos incluye levaduras, hongos dimórficos, dermatofitos, filamentosos y M. furfur. Su lipofília y su reducida solubilidad en agua, hace que la eficacia esté relacionada con el elevado tiempo de retención cutánea y su biodisponibilidad tópica unido a la buena tolerancia que presenta (Carrillo, 1995).
La eficacia clínica de este antifúngico (bifonazol 1%), está probada en el tratamiento experimental de dermatofitosis y candidosis, y se alcanzan tasas de curación elevadas en la mayoría de micosis superficiales con tratamientos de 2 a 3 semanas (Carrillo, 1995).

En veterinaria no esta bien documentado su uso, pero en algunos estudios recientes se describe que Malassezia pachydermatis es la levadura mas susceptible a la terapia tópica con productos azólicos (Outbridge, 2006)

2.9.2. Presentación

Es posible obtener el producto en preparaciones tales como ungüento tópico al 1%, loción al 1%, en polvo y eventualmente como ingrediente en la preparación de shampoo antimicótico (Bibliomed, 2000).

2.9.3 Farmacocinética y Farmacodinamia

a) Propiedades farmacocinéticas:

Absorción: El Bifonazol tiene una buena penetración en las capas cutáneas infectadas. Seis horas después de su administración las concentraciones en las diversas capas cutáneas van desde 1 000 g/cm3 en la capa superior de la epidermis (capa córnea) hasta 5 g/cm3 en la capa papilar. Por ende todas las concentraciones determinadas están dentro de un rango de actividad antimicótica confiable.

El tiempo de permanencia en la piel – medido por la acción protectora es de 48 a 72 horas en el caso de la crema de Bifonazol y de 36 a 48 horas para la solución de Bifonazol.

En virtud de las concentraciones en plasma extremadamente bajas (por lo general por debajo de 5 ng/ml) es improbable que se presente un efecto sistémico después de la aplicación tópica (Letelier, 2006).

b) Propiedades farmacodinámicas:

El Bifonazol es un derivado imidazólico con un amplio espectro antimicótico que incluye dermatófitos levaduras mohos y otros hongos como Malassezia furfur. También es efectivo en infecciones causadas por Corynebacterium minutissimum.

Los valores de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de los tipos de hongos mencionados se encuentran en niveles de menos de 0.062-4 (-16) g/ml de sustrato.

El Bifonazol tiene una notable actividad fungicida contra los dermatófitos en especial contra Trichophyton spp. Con una concentración de aproximadamente 5 g/ml y una exposición de 6 horas se logra un efecto totalmente fungicida.

En caso de las levaduras por ejemplo especies de Candida el efecto del Bifonazol a concentraciones de 1-4 g/ml es principalmente fungistático aunque a concentraciones de 20 g/ml es fungicida.

En los cocos grampositivos excluyendo los enterococos el Bifonazol tiene valores de CIM entre 4 y 16 g/ml. Cuando se trata de corinebacterias los valores de la CIM están entre 0.5 y 2 g/ml. La situación de resistencia para el Bifonazol es favorable (Letelier, 2006).

Las variables de resistencia primaria de las especies fúngicas sensibles son muy poco frecuentes (Letelier, 2006).

Hasta ahora las investigaciones no han proporcionado evidencia alguna de desarrollo de resistencia secundaria en cepas principalmente sensibles (Letelier, 2006).

El Bifonazol inhibe la biosíntesis del ergosterol en dos diferentes niveles lo que distingue a este agente de otros derivados azólicos y de otros antifúngicos que nada más actúan en un solo nivel. La inhibición de la síntesis de ergosterol provoca un deterioro estructural y funcional de la membrana citoplásmica (Letelier, 2006).

2.9.4. Usos recomendados

A nivel veterinario no está bien documentado su uso, sin embargo a nivel de medicina humana el producto ha sido utilizado en el tratamiento de la P. versicolor, candidiasis, dermatofitosis, diversas tiñas y onicomicosis. Aplicado una vez al día durante un período que varía entre las 2 y 4 semanas según la enfermedad a tratar (Bibliomed, 2000).


2.9.5. Reacciones adversas

Consisten en eritema, escozor, enrojecimiento, todo esto en caso de existir hipersensibilidad al producto y no eliminarlo por completo de la piel. Estas reacciones son menores en comparación a otros derivados azolicos de uso tópico como es el caso del Clotrimazol (Álvarez, 2006).
3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Materiales

3.1.1. Material biológico

Para la realización del siguiente estudio y alcanzar los objetivos descritos, se evaluaron 35 pacientes caninos, los cuales fueron facilitados por la Clínica Veterinaria Full Animals ubicada en la comuna de Recoleta.

Estos pacientes fueron seleccionados sin distinción de raza, edad y sexo, solo contar con el diagnostico clínico y citológico de Malassezia pachydermatis.

El Médico Veterinario de turno, fue el encargado de realizar la exploración clínica, a modo de determinar la presencia patológica de Malassezia pachydermatis, en tanto que la alumna tesista fue la encargada de realizar la toma de muestras y la posterior evaluación microscópica. Esta evaluación microscópica se realizó a partir de muestras obtenidas desde la zona afectada aplicando la técnica de impronta cutánea con Cinta Adhesiva Doble Fas. El análisis y tinción de las muestras se realizaron en las dependencias de la Clínica Veterinaria Full Animals.
3.1.2. Material no biológico

Para la obtención y procesamiento de las muestras se utilizaron los siguientes materiales:

a) Sobre para muestras de papel: Almacenamiento y transporte de las muestras extraídas.

b) Guantes de estériles: Su utilización estuvo basada con el fin de cumplir las mínimas normas de asepsia que requiere cada procedimiento médico.

c) Porta objetos de vidrio: En estos fueron colocadas cada una de las muestras los cuales fueron rotulados para posteriormente ser observadas en el microscopio.

d) Cinta adhesiva: Del tipo celofán Scotch 3M Doble fas (2cms de ancho) para extracción de muestras de cada uno de los pacientes. Esta cinta posee la característica de ser adhesiva en ambas caras.




e) Tinción Diff-quick®: Tinción seleccionada para procesar cada una de las muestras obtenidas de cada paciente. Sus características técnicas fueron especificadas anteriormente en el punto 2.7.3

f) Máquina fotográfica: Marca Olympus de 4.0 megapixeles para registro los hechos más relevantes durante el presente estúdio, como por ejemplo, procesamiento de muestras, observación de muestras, lavados realizados a los pacientes etc.

g) Microscopio óptico: Marca Nikon, binocular, observación y análisis citológico de cada una de las muestras previamente procesadas.

h) Aceite de inmersión: Para dar una mayor resolución y una imagen más clara de las muestras a observar en el microscopio.

i) Secador: Para el procesamiento de las muestras con el fin de fijarlas y para el secado de los pacientes posterior al lavado.

j) Ficha dermatológica: Registrar los datos más relevantes de cada uno de los pacientes (Punto 3.1.3)


k) Tijeras recta: Punta roma/roma, para corte de cinta adhesiva doble fas y tricotomía.

l) Agua: Para realizar los lavados con el producto a estudiar.

m) Shampoo hipoalergénico: Para eliminar suciedad y la capa de grasa previo a los lavados con Bifonazol 1% shampoo.

n) Bifonazol al 1% shampoo: Shampoo antimicótico para el tratamiento de Malassezia pachydermatis.
3.1.3. Ficha dermatológica
3.2. Método

El primer proceso fué el diagnostico de la presencia patológica de Malassezia pachydermatis. Los pacientes evaluados fueron facilitados por la Clínica Veterinaria Full Animals.

Para esto fue necesario realizar el examen clínico a cada posible paciente, en donde se observó si existía algún signo evidente de presencia de Malassezia pachydermatis que según Carlotti (2001) pueden ser prurito, eritema, pápulas, mal olor y en casos más crónicos hiperpigmentación de la zona afectada, liquenificación y alopecia traumática.

Con el fin de apoyar el examen clínico, se procede a realizar la toma de muestras, del paciente mediante la técnica de Impronta Cutánea con Cinta Adhesiva Doble Fas, en las zonas donde comúnmente se presenta este tipo de levadura, como por ejemplo cuello, axilas, abdomen, área inguinal, pabellón auricular, labios, hocico, área perianal y zona interdigital (Nobre, M. et al, 2000). Esta estuvo a cargo de la alumna tesista y fue supervisada por el Médico Veterinario de turno y consistió en:

Antes de realizar la toma de muestras la alumna tesista utiliza guantes estériles para mantener las mínimas normas de asepsia con el fin de evitar cualquier tipo de contaminación tanto para el paciente como para el que realiza este tipo de procedimiento.

Luego utilizando tijeras, se cortaron pequeños trozos de cinta adhesiva doble fas, de alrededor de 2.0 cms de ancho por 2.0 cms de longitud.

Luego se presionó firmemente la cinta sobre las zonas a muestrear ya que según Nobre (2000) de este modo se logra extraer el mayor número de células por cada zona.

En este estudio fueron evaluadas la zona abdominal, interdigital, inguinal y pabellón auricular

Se despegó y retiró la cinta de la zona muestreada colocándose sobre el portaobjeto dejando la muestra por el lado superior.

Ya ubicada la muestra en el portaobjeto se aplicó calor con mechero o encendedor, con el fin de fijar la muestra El calor es en general el método de fijación mas utilizado para la observación de la morfología de células. Este procedimiento según Zambrano (2003) se realiza con el fin de coagular el protoplasma de la célula y adherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se perdería la capa de células de las muestras durante el proceso de tinción, almacenamiento y traslado


Una vez fijadas se colocaron cada una en sobres para muestra, rotuladas cada uno con el nombre de cada paciente y la zona de la cual fue extraída la muestra, con el fin de facilitar el procesamiento y registro de datos para el estudio.

La tinción utilizada para la observación de las muestras fué realizada con el colorante Diff Quick® siguiendo el protocolo adecuado, mencionado en el Cuadro

Cuadro 3.1. Protocolo de tinción Diff Quick®

Protocolo de tinción Diff Quick®
Sumergir en Metanol 98% (fijador) 30 segundos
Esperar 15 segundos
Sumergir en Eosina 30 segundos
Esperar 15 segundos
Sumergir en Azul de metileno 30 segundos
Lavar con abundante agua con el objetivo de eliminar los últimos residuos
Secar cada muestra con papel absorbente, secador o temperatura ambiente




Fuente: Propia

3.2.1. Técnica de recuento celular.

La lámina portaobjeto ya fijada y teñida se coloca sobre la platina con la muestra colocada en la parte superior. Se colocó una gota de aceite de inmersión sobre la muestra cuyo fin según Vizcarrondo (2001), disminuye la desviación de los rayos luminosos dando una mayor nitidez al observar la muestra.

Posterior a esto, se bajó cuidadosamente el objetivo de inmersión (100X), observando lateralmente, hasta que el objetivo quede sumergido en el aceite.

Luego se debió enfocar la imagen con el tornillo micrométrico, este enfoque debe lograrse casi inmediatamente, puesto que la distancia de trabajo del objetivo de inmersión es relativamente corta. Finalmente se ajustó el condensador y diafragma hasta lograr la iluminación adecuada.

Para facilitar la observación al microscopio según Moya (2006), el portaobjeto fué dividido en 10 campos de observación con el fin de establecer la cantidad de Malassezia existente en cada muestra (Figura 3.1). Luego se procedió a contar las células observadas en cada uno de los 10 cuadros, sacando un promedio ( ) de las células observadas.

Figura 3.1. División de portaobjetos en 10 campos y calculo promedio de Malassezia pachydermatis.

3.2.2 Baños con Bifonazol 1% shampoo.

La preparación del producto se obtuvo a partir de recetario magistral® de Farmacias Ahumada, esta preparación esta compuesta de Bifonazol en concentración 1%, más el Shampoo base, todo esto en la cantidad de 2000cc. Este fué proporcionado al responsable del canino, entregándole a este las instrucciones en forma clara para su correcta aplicación.

a) Uso del Bifonazol
En este estudio se decidió utilizar Bifonazol 1% shampoo, puesto que según Álvarez (2006), es un excelente antimicótico imidazólico, de amplio espectro que actúa sobre dermatófitos, levaduras, mohos.

Si bien Letelier (2006) y otros autores no mencionan a Malassezia pachydermatis dentro de las levaduras sensibles a este producto, puesto que no se había probado aún su efectividad en veterinaria, si se ha probado en otras levaduras del mismo género que afectan a humanos como lo es Malassezia furfur, en donde esta es altamente sensible al Bifonazol. Pero si afirman que este producto en concentraciones de 20g/ml es fungicida, penetra bien en capas de la piel infectada. Además, seis horas después de su administración sus concentraciones exceden varias veces las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CIM) para hongos presentes en la capa superior de la epidermis (estrato córneo). Y la principal ventaja es que no es absorbido sistémicamente o lo es en muy baja proporción, en estudios de absorción en la piel humana sana, no se hallaron concentraciones detectables en suero; existe una ligera absorción (concentración sérica de 5ng/ml) después de su aplicación en piel inflamada, pero estos valores no provocarían efectos sistémicos.

Protocolo de Baños

1.- En primer lugar se procedió a realizar el lavado del paciente con shampoo hipoalergénico, marca Traper® (adecuado para la especie), con el fin de eliminar la capa de grasa y suciedad adherida en la piel (Bonagura, 2001).

2.- Inmediatamente se enjuagó hasta extraer por completo el producto.

3.- A continuación se realizó un segundo baño con Bifonazol al 1% shampoo, haciendo masajes suaves con el fin de lograr una mayor penetración y absorción del producto.

4.- Se dejó actuar el producto durante 15 minutos, ya que según Muse (2001) esto se debe realizar con el fin de que este alcance una buena concentración (CMI) y logre el efecto residual deseado.

5.- Pasados los 15 minutos se enjuagó bien la zona. La forma como se enjuaga una formulación de shampoo terapéutico del pelaje es muy importante, ya que la acumulación de shampoo puede llevar a causar irritación de la piel (Melman, 2005).

Los baños se realizaron cada 3 días por un período de 15 días con el propósito de evitar la formación de escamas producto de la aceleración del proceso de queratinización que se produce en respuesta a las agresiones producidas por levaduras y microorganismos patógenos.

Estos baños se realizaron tanto en la Clínica Veterinaria Full Animals como en el domicilio del paciente. En la misma sesión se coordinaron las futuras visitas, para que se llevaran a cabo las posteriores evaluaciones en los días 7 y 15 de tratamiento siendo los resultados registrados en las tablas correspondientes (Tabla 3.1. y 3.2.).
3.3 Análisis estadístico:

El cálculo del número de pacientes utilizados para la realización de este estudio se realizó con la siguiente fórmula:

N= Z2 * S2 / D2



Siendo Z: 1.96 (95% confiabilidad); S: Error estándar; D: Precisión.


Para el análisis de los resultados emanados del presente estudio se construyeron tablas y gráficos para caracterizar la evolución de los pacientes frente al tratamiento, estos incluyen el promedio general y la desviación estándar según días de tratamiento (1, 7, 15) y zona afectada.

Debido a las características descriptivas del presente estudio, no se aplicaron otras metodologías estadísticas.
Tabla 3.1. Evolución y respuesta al tratamiento con Bifonazol al 1%. (Evaluación Microscópica)

Tabla 3.2. Evolución y respuesta al tratamiento con Bifonazol al 1%. (Evaluación Microscópica).



4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Presentación de resultados
En la tabla anterior se ha registrado la información de los 35 pacientes estudiados, los cuales recibieron tratamiento durante un periodo de 15 días utilizando Bifonazol 1% shampoo, en donde se incluye el nombre del paciente, la zona muestreada, la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo diagnosticada el día 1 y la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo los días 7 y 15 de tratamiento.

4.1.2. Acción del Bifonazol 1% shampoo en el tiempo.

Grafico Nº 1

El grafico Nº 1 representa la acción del Bifonazol 1% shampoo en el tiempo, basado en la disminución de la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo, en donde se puede apreciar que previo al tratamiento se registra una media de 19 Malassezias por campo de observación, con valores en un rango de 5 hasta 100 Malassezias por campo.

Al día 7 con 2 lavados aplicados, se tiene una media de 5 Malassezias por campo con una disminución equivalente a un 73.6% en relación al día 1 y un rango que va desde 0 a 22 Malassezias por campo.

Luego entre el día 7 y el día 15 el descenso de Malassezias por campo no fue tan marcado correspondiendo este a un 40%. Al día 15 la media corresponde a 3 Malassezias por campo y un rango que va desde 0 a 20 Malassezias por campo, porcentualmente esto equivale a un 84.2% de disminución de la levadura en relación al día 1 considerando los 5 lavados realizados con el producto.
4.1.3. Acción del Bifonazol 1% shampoo en Abdomen.


Gráfico Nº2

El gráfico Nº2 representa la acción del Bifonazol 1% shampoo en la zona abdominal, basados en la disminución de la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo durante el período de tratamiento en esta zona. Entre el día 1 y 7 de tratamiento la presencia de Malassezia pachydermatis tuvo una disminución de un 61,5%. Entre los días 7 y 15, el tratamiento logró una disminución de un 33,3%, mientras que la acción del producto desde el inicio hasta el término del tratamiento logró una disminución de un 74,3% en la cantidad de Malassezia pachydermatis por campo en esta zona.
4.1.4. Acción del Bifonazol 1% shampoo en la zona Interdigital.

Gráfico Nº 3

El gráfico Nº 3 muestra la acción del Bifonazol 1% en la zona interdigital, basados en la disminución de la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis observada por campo. Siguiendo la tendencia global del estudio se aprecia un mayor grado de disminución de la presencia de la levadura entre el día 1 y 7 de tratamiento, en donde se registró una reducción de un 72,5% basados en los promedios obtenidos, luego entre los días 7 y 15, la reducción de la levadura fué de un 53,8%, mientras que las cifras entre el día 1 y 15 de tratamiento mostraron una disminución de un 87.3% en la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis observada por campo.
4.1.5. Acción del Bifonazol 1% shampoo en el Pabellón auricular derecho.

Gráfico Nº 4


El gráfico Nº 4 refleja los resultados de las muestras obtenidas a partir del Pabellón auricular derecho los días 1, 7 y 15 de tratamiento. Entre el día 1 y 7 de tratamiento con Bifonazol 1% shampoo, la disminución de Malassezia pachydermatis por campo, expresada en porcentaje fué de un 82,5%, luego entre los días 7 y 15, se registró una disminución de un 52,3% en la presencia de la levadura, mientras que el tratamiento desde el día 1 al día 15 obteniendo una disminución de un 91,6% en relación a la cantidad de Malassezias por campo obtenidas en la primera muestra.
4.1.5. Acción del Bifonazol 1% shampoo en el Pabellón auricular izquierdo.
Gráfico Nº 5

El gráfico Nº 5 muestra la acción del Bifonazol 1% shampoo sobre la cantidad de Malassezia pachydermatis observada por campo en el pabellón auricular izquierdo, en donde se aprecia una disminución marcada en la presencia de la levadura entre el día 1 y 7 de tratamiento (84,8%), mientras que contrariamente a lo observado en las otras zonas descritas, entre el día 7 y 15 se mantiene la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis observada por campo, lo que se explica por los resultados individuales del paciente Nº 18, en donde el responsable de la mascota no habría efectuado el tratamiento durante este período. El resultado final del tratamiento aplicado en esta zona arrojó una disminución de un 82,2% en la cantidad de Malassezia pachydermatis por campo.
Gráfico Nº 6

El gráfico Nº 6 muestra los resultados en la zona del pabellón auricular izquierdo omitiendo los datos del paciente Nº 18, de este modo se puede observar que la gráfica sigue la tendencia general.


4.1.6. Situación en piel según cantidad de Malassezia pachydermatis durante el tratamiento con Bifonazol al 1% shampoo.
Gráfico Nº 7

En el gráfico Nº 7 se puede observar la situación en piel de los caninos a ser tratados con Bifonazol al 1% shampoo, en donde el 63% de los casos presentaban una condición grave o crítica (más de 10 Malassezias por campo) mientras que el 37% presentaba una condición leve (entre 4 y 10 Malassezia por campo).



Gráfico Nº 8

En el gráfico Nº 8 se puede observar la gran proporción de casos que alcanzaron niveles de normalidad (77%) luego de 2 baños consecutivos con Bifonazol al 1% shampoo, los casos críticos disminuyeron en un 23% en relación a lo expresado en el gráfico Nº 7.

Gráfico Nº 9

En el gráfico Nº 9 se puede observar la ausencia de casos críticos luego de 15 días de tratamiento con Bifonazol 1% shampoo, además se aprecia un alto porcentaje de casos que alcanzaron niveles de normalidad (83%). Los casos graves disminuyeron a un 11% y los casos leves registrados (6%) corresponden a pacientes que anteriormente presentaban niveles graves o críticos.
4.2 Discusión

4.2.1 Discusión general del estudio

En el tratamiento de la presencia patológica de Malassezia pachydermatis en caninos, se han utilizados diversos productos, es así como dentro de los azoles los más nombrados son el ketoconazol, itraconazol y fluconazol, disponibles en presentación oral y uso tópico (Muse, 2001), pero presentan desventajas significativas como el caso del ketoconazol que por su baja absorción por vía tópica (Goodman, 2003) se administra por vía sistémica con alto riesgo de hepatotóxicidad si no son bien reguladas las dosis (Muller, 2007). En cuanto a los otros azoles mencionados, presentan la disyuntiva de tener menos efectos adversos pero una menor efectividad sobre Malassezia sp y mayor costo en relación a los otros fármacos (Álvarez, 2006).

Entonces resulta importante la búsqueda de nuevas alternativas de tratamiento con un mayor equilibrio entre efectividad y efectos adversos. Ante esto el Bifonazol en concentración al 1% presentación de shampoo proporcionó la concentración necesaria para el control de la levadura y su uso tópico minimiza los efectos adversos para el paciente (Letelier, 2006).

El Bifonazol 1% shampoo fue utilizado para el tratamiento de Malassezia pachydermatis, en consideración a que este producto es un antifúngico de amplio espectro, fungicida y con efecto antinflamatorio, el cual posee buena penetración en las capas cutáneas infectadas y muy bajas concentraciones en plasma producto de su aplicación tópica, además de producir menos efectos adverso en relación a otros derivados azólicos (Álvarez, 2006).

El Bifonazol ha sido probado principalmente como producto antifúngico a nivel de Medicina Humana, logrando buenos resultados en el tratamiento tópico de la Pitiriasis versicolor cuyo agente etiológico es Malassezia furfur (Carrillo, 1995), si bien esta levadura tiene mayor afinidad por las características de la piel humana, en estudios recientes esta levadura lipodependiente ha sido identificada y aislada a partir del canal auditivo de caninos con otitis externa (Crespo et. al., 2002), esto puede resultar importante considerando que en este estudio 5 de los caninos tratados cursaban con otitis externa.

Si bien el enfoque del estudio es hacia el tratamiento de Malassezia pachydermatis, es importante señalar que la técnica citológica utilizada para el diagnóstico de la presencia de la levadura y posterior evaluación del tratamiento, es utilizada principalmente por su sensibilidad pero su especificidad es cuestionable por tanto el uso de cultivos fúngicos es importante para identificar la especie correcta (Ochoa, 2006), esto plantea que existe la posibilidad de que en algunos casos la levadura presente en los caninos fuese Malassezia furfur en vez de Malassezia pachydermatis.

El diagnóstico de Malassezia así como los controles para evaluar la acción del tratamiento se realizó usando la técnica citológica con Cinta Adhesiva Doble Fas, ya que de acuerdo a lo expuesto por Moya (2006), esta técnica permite la recolección de un mayor número de Malassezias en relación a otras técnicas citológicas. Además permite la obtención de muestras en lugares de difícil acceso como pliegues cutáneos, espacios interdigitales y mucosas (Nobre, M. et al, 2000), además es un método accesible, rápido y económico de realizar obteniéndose mejores resultados en comparación a otras técnicas diagnosticas (Carlotti, 2001).

Si bien existen otras técnicas que consideran por ejemplo, el uso directo del portaobjeto o la utilización de tórulas de algodón, las cuales entre ellas se diferencian por una mayor o menor sensibilidad, ninguna ha sido aceptada como técnica estándar y la elección de una técnica u otra se basa más bien en las características propias de cada estudio (Cafarchia. et. al, 2005).

La evaluación citológica se realizó con la aplicación previa de la tinción Diff Quick® que es una tinción rápida, de buena calidad y sugerida por diversos autores, esta tinción aportó un buen detalle y diferenciación celular, un detalle nuclear aceptable y permitió además una tinción adecuada de las levaduras, tal como ha sido descrito por Ellis (2007).

En esta investigación no se realizó distinción entre edad ni sexo, en relación a la presencia patológica de Malassezia pachydermatis puesto que según Carlotti (2001), Girao (2006) y otros autores estos no son factores predisponentes en la ocurrencia de dermatitis por Malassezia.

En los pacientes evaluados y posteriormente diagnosticados se pudo observar como signos clínicos principalmente prurito, olor desagradable, eritema. Muse (2001), Carlotti (2001), y muchos otros autores establecen y describen como signos clínicos de Malassezia pachydermatis principalmente prurito, olor desagradable, eritema, pápulas, hiperpigmentación y alopecia.

La identificación de Malassezia pachydermatis estuvo basada en la descripción morfológica descrita por Carlotti (2001), Girao (2006), Giusiano (2006) y otros, en donde describen que esta posee forma oval o típica de maní esto debido a la gemación unipolar de las células hijas en un sitio de la pared celular.

Las zonas evaluadas en esta investigación, corresponden a las zonas con mayor frecuencia de presentación de Malassezia, puesto que según Outbridge (2006) son estas las que poseen las características de humedad y nutrición necesarias para un mayor crecimiento de la levadura.

Muse (2001), Outbridge (2006), y otros autores señalan que Malassezia pachydermatis es un comensal habitual de la piel, tanto en caninos sanos como con patologías dermatológicas, por tanto su eliminación completa por un período prolongado es compleja.

Antes de realizar los baños con el producto, se realizó un baño con shampoo hipoalergénico, puesto que su uso disminuye la cantidad de shampoo terapéutico necesario, además según Bonagura (2001) esto facilita la aplicación profunda del producto terapéutico y se elimina la capa de grasa y suciedad adherida en la piel.

Los baños con Bifonazol 1% shampoo incluyeron un enjuague a los 15 minutos de haber sido aplicado el shampoo, ya que según Melman (1994) y otros autores, es necesario que el producto permanezca en la piel durante este período para obtener una mejor respuesta frente al tratamiento y lograr una concentración mínima inhibitoria óptima que permita un mayor efecto residual.

La periodicidad con la que se realizaron los baños fue cada 3 días, es decir 2 veces a la semana, lo que concuerda con lo dicho por Carlotti (2001) y Lujan (2006) en donde plantea que los tratamientos tópicos inicialmente se realizan de 2 a 3 veces por semanas por 2 semanas con el fin de normalizar los procesos de queratinización y luego se disminuye la frecuencia a 1 baño por semana obteniendo buenos resultados.

En base a los resultados obtenidos en el presente estudio se puede señalar que la terapia tópica con el uso de Bifonazol 1% shampoo por si solo es suficiente para el control de Malassezia pachydermatis evitando los efectos hepatotóxicos que genera la terapia sistémica lo cual contrasta con lo descrito por Muse (2001), y muchos otros autores los cuales aseguran que la terapia tópica debe acompañarse necesariamente del uso de antimicóticos sistémicos.
El tratamiento con Bifonazol 1% shampoo tuvo excelentes resultados, esto tiene relación con lo planteado por Outbridge (2006), en donde afirma que Malassezia pachydermatis es altamente sensibles a la terapia tópica basada en productos azólicos. Además Carrillo (1995) asegura que por su reducida solubilidad en agua, hace que la eficacia esté relacionada con el elevado tiempo de retención cutánea y su biodisponibilidad tópica unido a la buena tolerancia que este antimicótico presenta.

4.2.2. Discusión de valores obtenidos

La respuesta al tratamiento experimentada por los pacientes en términos globales, en especial entre los días 1 y 7, es indicativo que la concentración utilizada de Bifonazol al 1% es la adecuada para el tratamiento de Malassezia pachydermatis, esto concuerda con lo señalado por Letelier (2006) en donde se indica Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) entre 4gr/ml a 20 gr/ml serían las indicadas para el tratamiento de patologías producidas por levaduras.

Al observar el comportamiento de los gráficos se evidencia que en la primera mitad del tratamiento es donde ocurre la mayor disminución de Malassezia pachydermatis por campo (entre un 46,10% y un 89,07% según la zona), observando un promedio general de 4,77 Malassezias por campo al día 7 de tratamiento, mientras que en la segunda mitad del tratamiento la disminución en la cantidad de levaduras fue notoriamente menor (12,5%) observando un promedio de 2,94 Malassezias por campo de observación. Esto se explica por el hecho que al día 7 se registran valores cercanos a los valores de normalidad para la presencia de Malassezia pachydermatis en piel, según los valores indicados por Larson (1998), además es importante considerar que Malassezia pachydermatis constituye parte de la flora normal de la piel de caninos y por tanto no puede ser completamente eliminada, tal como lo señala Muse (2001).

En una cantidad importante de casos (pacientes Nº 2,5,6,19,20,26,31) que corresponde al 20% de los casos, el Bifonazol al 1% shampoo logró reducir de manera significativa la presencia de Malassezia pachydermatis luego de tan solo una semana de tratamiento pasando de un estado crítico a un estado de normalidad (ver gráficos 7 y 8), esto se correlaciona con lo señalado por Sumenshine (1998) en cuanto a que el Bifonazol de uso tópico puede conseguir resultados rápidos entre 1 a 2 semanas.

En el caso de los pacientes Nº 22, 27 y 28 el tratamiento no fue suficiente para alcanzar un estado de normalidad después de 15 días de aplicación del producto en los intervalos establecidos en este estudio, estos pacientes presentaban afecciones bacterianas de la piel en concomitancia con Malassezia pachydermatis con una inmunosupresión evidente y trastornos en la queratinización lo que influye negativamente en la respuesta al tratamiento (Muse, 2001). Es en estos casos que se sugiere prolongar el tratamiento durante una o dos semanas adicionales (Alvarez, 2006) y a la vez tratar los factores predisponentes que favorecen el crecimiento excesivo de la levadura (Carlotti, 2001).

En términos generales los baños se realizaron con la frecuencia indicada (cada 3 días), a excepción de los casos Nº 13 y 18 en donde la frecuencia de baños se prolongó por más de 3 días entre un baño y otro en especial después del día 7 de tratamiento. Es importante considerar que el tiempo de acción en piel del Bifonazol va de 36 a 48 horas desde su aplicación (Álvarez, 2006) por tanto prolongar el intervalo de aplicación del producto incide directamente en los resultados.

En el caso de la paciente Nº 12 se evidencia una situación muy particular, en donde al día 7 de tratamiento se observó un incremento en la cantidad de Malassezia pachydermatis por campo en comparación al día 1, esta situación podría estar asociada a fallas en la técnica citológica principalmente en el procedimiento de fijación por calor o flameo, puesto que si este no se realiza en forma adecuada se perderían capas de células de las muestras durante el proceso de tinción, almacenamiento y traslado (Zambrano, 2003).

De todas las zonas evaluadas la región abdominal es la que evidenció la menor respuesta al tratamiento (ver gráficos 2, 3, 4 y 5), obteniendo una media de 4,29 Malassezia pachydermatis por campo al día 15 de tratamiento, sin embargo las gráficas muestran que se mantiene la tendencia global, con una efectividad del producto durante el período de tratamiento en esta zona de un 74,3% basados en la disminución de la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo evaluada a los días 7 y 15 de tratamiento. Esta menor efectividad puede estar relacionada con el echo que Malassezia pachydermatis tiene una mayor presencia en la zona abdominal, en comparación a otras regiones, por la mayor cantidad de sebo, nivel de humedad y pliegues existentes que favorecen el desarrollo de la levadura (Moya, 2006).

5. CONCLUSIONES

Ø Se puede concluir que los objetivos propuestos en este estudio se alcanzaron de forma satisfactoria, dado que se pudo comprobar la acción del Bifonazol 1% shampoo basándose en la disminución de la cantidad promedio de Malassezia pachydermatis por campo de observación durante 15 días de tratamiento.

Ø La aplicación tópica del Bifonazol 1% shampoo posee una serie de ventajas tales como ausencia de interferencias con el uso de otros medicamentos orales o parenterales, presenta menos efectos secundarios e interacciones farmacológicas, que sí pueden aparecer con el uso de antifúngicos orales.

Ø Para el correcto diagnostico de Malassezia pachydermatis es necesario realizar un examen clínico exhaustivo, siendo muy importante la anamnesis realizada por el Médico Veterinario, puesto que existen un sinnúmero de factores predisponentes para la presentación de esta levadura. El examen clínico se debe complementar con la técnica citológica utilizada en esta investigación, que es la utilización de Cinta adhesiva doble fas para asegurar la recolección de un mayor número de Malassezia sp., siendo esta una técnica sencilla y económica de realizar.



Ø Es importante considerar para mayor efectividad y seguridad de que los baños se realicen en forma adecuada, estén bajo la supervisión de un Médico Veterinario.

Ø La terapia con Bifonazol 1% shampoo tuvo muy buenos resultados, puesto que Malassezia pachydermatis es altamente sensible a los productos tópicos con derivados azólicos.

Ø El Bifonazol 1% shampoo, es una buena elección como tratamiento para este tipo de levaduras, porque además de tener propiedades fungicidas, tiene efecto antinflamatorio que puede contribuir al alivio de la sintomatología clínica de los pacientes que cursan patologías dermatológicas asociadas a Malassezia pachydermatis.

Ø Se sugiere realizar cultivos fúngicos como método de apoyo para determinar con mayor precisión la especie de Malassezia sp. a tratar.
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